表达 IgM 抗体的细胞系开发

免疫球蛋白 G (IgG) 抗体已被研究并作为生物制药应用了几十年，它们在单克隆抗体 (MAb) 管线中仍然占主导地位。相比之下，免疫球蛋白 M (IgM) 分子要大得多，因此在生物制造和治疗应用方面更具挑战性。本质上，它们看起来像是熟悉的 Y 形 IgG 分子簇，以五聚体（图 1）或六聚体形式在碱基处连接。该结构分别使它们具有 10 和 12 个结合部分，这意味着与 IgG 异构体相比，抗体具有更高的结合力（亲和力）。

位于加利福尼亚州山景城的 IGM Biosciences 公司认为，IgM 在治疗某些疾病方面可能比 IgG 更有效，尤其是癌症免疫疗法。过去，许多研究人员一直受困于 IgM 制造的技术障碍。但在过去 10 年中，IGM 的科学家和工程师取得了一系列突破，如今，该公司成为唯一一家能够在其专用的符合良好生产规范 (GMP) 的设施中高效生产 g/L 级工程化 IgM 抗体的开发商。

Christina Pingchuan Tsai自 2021 年起担任 IGM 细胞系开发小组的高级科学家。她在三星生物制剂公司和 Hengenix Biotech 拥有八年专注于细胞系和生物制剂生产工艺开发的行业经验，擅长使用蛋白质组学/基因组学检测和下一代测序 (NGS) 进行高通量细胞培养筛选和纯化以及细胞系表征。此前，她在微生物组治疗行业工作了五年，同样专注于 NGS 分析和检测开发以及样品保存和噬菌体生产。

蔡女士于 2003 年获得台湾国立清华大学化学学士学位，2009 年获得德克萨斯农工大学生物化学博士学位，2010 年至 2012 年在斯坦福大学从事博士后研究。在那里，她开发了蛋白质表征检测方法，并在美国国立卫生研究院癌症生物学项目颁发的奖学金资助下研究了针对癌细胞的双特异性/多特异性抗体。

BPI West 演讲
Tsai 在加利福尼亚州圣地亚哥举行的 BioProcess International US West 会议和展览会（2022 年 3 月）上的演讲题为“细胞系开发过程中 IgM 分子的细胞系表征”。在演讲中，她强调了细胞、代谢、蛋白质组学和基因组学研究的重要性。她证明了临床结果表明 IgM 比 IgG 具有更高的效力，这体现在更强和更具生理性的结合，从而改善了对 T 细胞活化的控制。她的公司致力于将 IgG 转化为 IgM 结构以增加亲和力，然后对这些分子进行工程改造以提高特异性并延长体内半衰期，最后创建了双特异性抗体形式。

蔡教授总结了其团队的细胞系开发工作流程：

• 转染选定的细胞池以产生单克隆
• 筛选单克隆的生长
• 通过滴度、生长和蛋白质质量评估缩小顶级克隆范围。
• 测试少量顶级克隆的稳定性（在生物反应器中）。

具有最高稳定性和特定生产力的细胞系被选为最终的先导克隆。细胞系的特征在于其生长和生产力、其表达的蛋白质的质量（最好是五聚体形式）以及其在生物反应器培养中的生存力和行为。基因组表征用于确保转基因完整性和评估突变，最终克隆进一步测试其生长和稳定性。效力和 ELISA 测定有助于确定所产生抗体的质量。

我们的谈话
在我们在 BPI West 见面之前，我与蔡英文进行了虚拟聊天，谈论了她在那里演讲的主题。

IgM 作为潜在生物治疗药物的主要吸引力是什么？您能告诉我们与更常见的 IgG 相比，它们的结合力和强度如何吗？IgM 有 10 个臂可以结合靶抗原，而 IgG 只有两个臂。额外的结合位点提供了更好的结合力（增强的结合亲和力）。

我们临床 2 期计划中的 IGM-2323 分子在癌细胞上有 10 个 B 淋巴细胞抗原 CD20 结合位点，在 T 细胞上有 1 个 CD3 蛋白复合物结合位点，因此它可以与癌细胞结合并吸引 T 细胞杀死它们。这种新型双特异性 IgM 抗体通过 T 细胞定向细胞毒性 (TDCC) 发挥强效活性，并保留了 IgM 抗体特有的强大的补体依赖性细胞毒性 (CDC) 活性。在我们的临床前研究中，它还显示出与 IgG 相比细胞因子释放减少。这可以解释 1 期临床试验期间报告的不良反应发生率低的原因 ( 1 )。

开发和制造 IgM 抗体面临哪些技术挑战？一些研究人员报告称，IgM 存在溶解度限制和加工过程中变性趋势（2-4）。贵公司如何应对这些困难？开发和制造 IgM 分子的主要技术挑战是获得正确的格式。IgM 有五聚体和六聚体形式，我们主要专注于开发含有开放 J 链的五聚体形式。在 IgM 纯化中，我们不能使用蛋白 A 将抗体与细胞培养上清液中的杂质分离，因为 IgM 不含蛋白 A 结合基序。我们已经开发出专有工艺来分离高纯度的 IgM 分子。

具体来说，转向细胞系开发，BPI 大约 10 年前发表了关于 PER.C6 细胞中 IgM 表达的报告 (5)。您使用哪种细胞系来生产 IgM？它们有什么特殊挑战吗？我们使用产生生物制剂的典型细胞系。它们既不难操作，也不难表征 IgM 生产。我们必须确保细胞系产生的五聚体 IgM 分子符合我们的质量考虑。

IgM 五聚体结构看起来像是由二硫键连接的五个 IgG 组成的环。这五个部分通常是彼此重复的，还是每个部分都有自己的结合靶标？我们的 IgM 分子在五个部分上有一个重复的结合基序。我们的一些分子是双特异性的，它们的 J 链上有另一个结合基序。

IgM 的大尺寸（^{~ 900+ kDa）是否意味着比 IgG（}^~150 kDa）的基因序列大得多，并且这会使 IgM 表达载体的生成/整合变得复杂吗？用于 IgM 生成的质粒包含编码重链、轻链和 J 链的基因。这些质粒与 IgG 的质粒之间没有太多差异。我们没有发现 IgM 生成的质粒生成和基因整合存在困难。它可能比用于 IgG 表达的典型质粒更大。

您在 BPI West 的演讲中重点介绍了细胞系和产品表征方法。您使用了哪些技术？我的演讲主要侧重于克隆选择的表征技术。我们使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)、ELISA、效力测定、生物反应器筛选和稳定性研究。这些测定对于表征能够以最佳质量和理想生产率产生 IgM 的细胞系非常重要。生物反应器筛选用于研究来自不同克隆的代谢物。考虑到达到规模所需的代数，细胞年龄稳定性研究对于确定所选细胞系是否能够随着细胞年龄的增加以相当的生产率产生 IgM 至关重要。

不能使用 Protein A 纯化，尽管其他亲和层析树脂已在市场上销售，可用于研究规模的纯化，但它们目前无法扩展 ( 6 )。因此，我们使用不同类型的层析技术进行 IgM 纯化。

为什么你们在 IgM 产品质量评估中重点关注 J 链？ J 链是形成五聚体 IgM 分子的关键成分之一。如果缺少 J 链，其他形式的 IgM 仍可表达。我们第 2 阶段临床试验中的 IGM-2323 在其 J 链上确实含有 CD3 结合基序。在我们的一些表征分析中，我们测量了克隆中 J 链的相对量，这对于 T 细胞活化至关重要。

时间线在细胞系开发中越来越重要。自动化技术已帮助许多 IgG 开发人员加快其工程和选择过程。您能对 IgM 流程做同样的事情吗？是的，我们正在构建自动化功能以改进我们的克隆选择过程。这项技术帮助我们筛选出更多具有高表达滴度和稳定性的克隆。